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The generation and maintenance of intricate spatiotemporal patterns of gene expression in multicellular organisms requires the establishment of complex mechanisms of transcriptional regulation. Estimations that up to one million enhancers exist in the human genome accentuates the utmost importance of this type of cis-regulatory element for gene regulation. However, surprisingly little is known about the mechanisms used to temporarily or permanently activate or inactivate enhancers during cellular differentiation. The current work addresses the question how enhancer regulation can be achieved.
Using the chemokine (C-C motif) ligand gene Ccl22 as a model, the first example is based on the question how the activation of an enhancer can be prevented in a physiological context. Ccl22 is expressed by myeloid cells, such as dendritic cells, upon exposure to inflammatory stimuli. The expression in other cell types, such as fibroblasts, is prevented by the strong accumulation of H3K9me3 at the enhancer's proximal region. This accumulation is attenuated in myeloid cells through activity of the stimulus-induced demethylase Jmjd2d. To tease out which genomic fragment or fragments in the Ccl22 locus could be responsible for the maintenance of enhancer inactivity, potentially through the recruitment of H3K9 methyltransferases, the enhancer repressing capacity of 1 kb fragments of the gene locus was analysed in retroviral reporter assays. It was found that a fragment adjacent to the Ccl22 enhancer that overlaps with a member of a subfamily of long interspersed nuclear elements (LINEs) showed strong repressive potential on a model enhancer. Subsequent retroviral reporter assays with LINEs from loci of other stimulus-dependent genes identified additional LINE fragments that exhibit strong enhancer repressive capacity. These findings suggest a mechanism for enhancer silencing involving LINEs.
The second example concentrates on the inactivation of an enhancer during colorectal cancer (CRC) progression. The adenoma to carcinoma transition during CRC progression often is accompanied by a downregulation of the tumour suppressor gene EPHB2. The EMT inducing factor SNAIL1 strongly downregulated EPHB2 expression in a CRC cell model. To gain insights into the transcriptional regulation of EPHB2, potential cis-regulatory elements in the EPHB2 upstream region were analysed using reporter assays. A cell-type-specific enhancer was identified and subsequent chromatin analyses revealed a correlation between enhancer chromatin conformation and EPHB2 expression in different CRC cell lines. Additionally, the overexpression of the murine Snail1 induced chromatin changes at the EPHB2 enhancer towards a poised, transcriptionally silent chromatin conformation. Mutational analyses of the minimal enhancer region pinpointed three transcription factor binding motifs to be essential for full enhancer activity. Different binding patterns between CRC cell lines at the TCF/LEF motif were subsequently identified. Furthermore, a switch from TCF7L2 to LEF1 occupancy was found upon overexpression of Snail1 in vitro and in vivo. The generation of LS174T CRC cells overexpressing LEF1 confirmed the involvement of LEF1 in the downregulation of EPHB2 and the competitive displacement of TCF7L2. This part of the work demonstrated that the SNAIL1 induced downregulation of EPHB2 is dependent on the decommissioning of a transcriptional enhancer and led to a hypothetical model involving LEF1 and ZEB1.
In summary, this work highlighted two distinct mechanisms for enhancer regulation. One mechanism is based on enhancer repressive LINE fragments that might prevent stimulus-dependent enhancer activation. In the second, enhancer silencing was shown to be based on a competitive transcription factor binding mechanism.
The human enzymes GLYAT (glycine N-acyltransferase), GLYATL1 (glutamine N-phenylacetyltransferase) and GLYATL2 (glycine N-acyltransferase-like protein 2) are not only important in the detoxification of xenobiotics via the human liver, but are also involved in the elimination of acyl residues that accumulate in the form of their coenzyme A (coA) esters in some rare inborn errors of metabolism. This concerns, for example, disorders in the degradation of branched-chain amino acids, such as isovaleric acidemia or propionic acidemia. In addition, they also assist in the elimination of ammonium, which is produced during the transamination of amino acids and accumulates in urea cycle defects. Sequence variants of the enzymes have also been investigated, which may provide evidence of impaired enzyme activities, from which therapy adjustments can potentially be derived. A modified Escherichia coli strain was chosen for the overexpression and partial biochemical characterization of the enzymes, which may allow solubility and proper folding. Since post-translational protein modifications are very limited in bacteria, we also attempted to overexpress the enzymes in HEK293 cells (human-derived). In addition to characterization via immunoblots and activity assays, intracellular localization of the enzymes was also performed using GFP coupling and confocal laser scanning microscopy in transfected HEK293 cells. The GLYATL2 enzyme may have tasks beyond detoxification and metabolic defects and the preliminary molecular biology work has been performed as part of this project - the enzyme activity determinations were outsourced to a co-supervised bachelor thesis. The enzyme activity determinations with purified recombinant human enzyme from Escherichia coli provided a threefold higher activity of the sequence variant p.(Asn156Ser) for GLYAT, which should be considered as the probably authentic wild type of the enzyme. In addition, a reduced activity of the GLYAT variant p.(Gln61Leu), which is very common in South Africa, was shown, which could be of particular importance in the treatment of isovaleric acidemia, which is also common in South Africa. Intracellularly, GLYAT and GLYATL1 could be localized mitochondrially. As the analyses have shown, sequence variations of GLYAT and GLYATL1 influence their enzyme activity. As an example, the GLYAT variant p.(Gln61Leu) is frequently found in South Africa. In the case of reduced GLYAT activity, patients could be increasingly treated with L-carnitine in the sense of an individualized therapy, since the conjugation of the toxic isovaleryl-coA with glycine is restricted by the GLYAT sequence variation. Activity-reducing variants identified in this project are of particular interest, as they may influence the treatment of certain metabolic defects.
Typically, plastic packaging materials are produced using additives, like e.g. stabilisers, to introduce specific desired properties into the material or, in case of stabilisers, to prolong the shelf life of such packaging materials. However, those stabilisers are typically fossil-based and can pose risks to both environmental and human health. Therefore, the present study presents more sustainable alternatives based on regional renewable resources which show the relevant antioxidant, antimicrobial and UV absorbing properties to successfully serve as a plastic stabiliser. In the study, all plants are extracted and characterised with regard to not only antioxidant, antimicrobial and UV absorbing effects, but also with regard to additional relevant information like chemical constituents, molar mass distribution, absorbance in the visible range et cetera. The extraction process is furthermore optimised and, where applicable, reasonable opportunities for waste valorisation are explored and analysed. Furthermore, interactions between analysed plant extracts are described and model films based on Poly-Lactic Acid are prepared, incorporating analysed plant extracts. Based on those model films, formulation tests and migration analysis according to EU legislation is conducted.
The well-known aromatic and medicinal plant thyme (Thymus vulgaris L.) includes phenolic terpenoids like thymol and carvacrol which have strong antioxidant, antimicrobial and UV absorbing effects. Analyses show that those effects can be used in both lipophilic and hydrophilic surroundings, that the variant Varico 3 is a more potent cultivar than other analysed thyme variants, and that a passive extraction setup can be used for extract preparation while distillation of the Essential Oils can be a more efficient approach.
Macromolecular antioxidant polyphenols, particularly proanthocyanidins, have been found in the seed coats of the European horse chestnut (Aesculus hippocastanum L.) which are regularly discarded in phytopharmaceutical industry. In this study, such effects and compounds have been reported for the first time while a valorisation of waste materials has been analysed successfully. Furthermore, a passive extraction setup for waste materials and whole seeds has been developed. In extracts of snowdrops, precisely Galanthus elwesii HOOK.F., high concentrations of tocopherol have been found which promote a particularly high antioxidant capacity in lipophilic surroundings. Different coniferous woods (Abies div., Picea div.) which are in use as Christmas trees are extracted after separating the biomass in leafs and wood parts before being analysed regarding extraction optimisation and drought resistance of active substances. Antioxidant and UV absorbing proanthocyanidins are found even in dried biomasses, allowing the circular use of already used Christmas trees as bio-based stabilisers and the production of sustainable paper as a byproduct.
Telogene Einzelhaare sind häufig vorkommende Spurentypen an Tatorten. Derzeit werden sie zumeist von der STR-Typisierung ausgeschlossen, weil ihre STR-Profile aufgrund geringer DNA-Mengen und starker DNA-Degradierung in vielen Fällen unvollständig und schwierig zu interpretieren sind. In der vorliegenden Arbeit wurde eine systematische Vorgehensweise angewandt, um Korrelationen zwischen der DNA-Menge und DNA-Degradierung zu dem Erfolg der STR-Typisierung aufzuweisen und darauf basierend den Typisierungs-Erfolg von DNA aus Haaren vorhersagen zu können.
Zu diesem Zweck wurde ein human- (RiboD) und ein canin-spezifischer (RiboDog) qPCR-basierter Assay zur Messung der DNA-Menge und Bewertung der DNA-Integrität mittels eines Degradierungswerts (D-Wert) entwickelt. Aufgrund der Lage der genutzten Primer, welche auf ubiquitär vorkommende ribosomale DNA-Sequenzen abzielen, ist das Funktionsprinzip schnell und kostengünstig auf unterschiedliche Spezies anzuwenden. Die Funktionsweise der Assays wurde mittels seriell degradierter DNA bestätigt und der humane Assay wurde im Vergleich zum kommerziellen Quantifiler? Trio DNA Quantification Kit validiert. Schließlich wurde mit den Assays an DNA aus telogenen und katagenen Einzelhaaren von Menschen und Hunden der Zusammenhang zwischen DNA-Menge und DNA-Integrität zu der Vollständigkeit der STR-Allele (Allel Recovery) von DNA-Profilen untersucht, die mittels kapillarelektrophoretischer (CE) STR-Kits erhaltenen wurde. Es zeigte sich, dass bei humanen Einzelhaaren die Allel-Recovery sowohl von der DNA-Menge als auch der DNA-Integrität abhängt. Dagegen war die DNA-Degradierung bei einzelnen Hundehaaren durchweg geringer und die Allel-Recovery hing allein von der extrahierten DNA-Menge ab.
Um die STR-Analytik degradierter humaner DNA-Proben weiter zu verbessern, wurde ein neuartiger NGS-basierter Assay (maSTR, Mini-Amplikon-STR) etabliert, der die 16 forensischen STR-Loci des European Standard Sets und Amelogenin als sehr kurze Amplikons (76-296 bp) parallel amplifiziert. Mit intakter DNA generierte der maSTR-Assay im Mengenbereich von 200 pg eingesetzter DNA reproduzierbare, vollständige Profile ohne Allelic Drop-ins. Bei niedrigeren DNA-Mengen traten vereinzelt Allelic Drop-ins auf, wobei unter Verwendung von mindestens 43 pg DNA vollständige Profile erhalten wurden.
Die kombinierte Strategie aus RiboD-Messungen der DNA-Menge und -Integrität und daraus resultierendem STR-Typisierungserfolg des maSTR-Assays wurde an degradierter DNA validiert. Anschließend wurde die Strategie auf DNA aus telogenen und katagenen Einzelhaaren angewandt und mit den Ergebnissen des CE-basierten PowerPlex? ESX 17-Kits verglichen, das dasselbe STR-Marker-Set analysiert. Dabei zeigte sich, dass der Erfolg der STR-Typisierung beider STR-Assays sowohl von der optimalen Menge der Template-DNA als auch von der DNA-Integrität abhängt. Mit dem maSTR-Assay wurden vollständige Profile mit ungefähr 50 pg Input-DNA für leicht degradierte DNA aus Einzelhaaren nachgewiesen, sowie mit ungefähr 500 pg stark degradierter DNA. Aufgrund der geringen DNA-Mengen von telogenen Einzelhaaren schwankte die Reproduzierbarkeit der maSTR-Ergebnisse, war jedoch stets dem PowerPlex? ESX 17-Kit in Bezug auf die Allel-Recovery überlegen.
Ein Vergleich mit zwei, hinsichtlich der Längenverteilung der Amplikons komplementären CE-basierten STR-Kits (PowerPlex? ESX 17 und ESI 17 Fast), sowie mit einem kommerziellen NGS-Kit (ForenSeq? DNA Signature Prep) ergab, dass nicht die Technik der NGS, sondern die Kürze der Amplikons der wichtigste Faktor zur Typisierung degradierter DNA ist. Der maSTR-Assay wies in allen Vergleichen mit den genutzten kommerziellen Kits jedoch eine höhere Anzahl an Allelic Drop-ins auf. Diese traten umso häufiger auf, je geringer die verwendete DNA-Menge und je stärker degradiert diese war.
Weil Profile mit Allelic Drop-ins Mischprofilen entsprechen, wurden die per maSTR-Assay generierten STR-Profile mit Verfahren zur Interpretation von Mischspuren untersucht. Bei der Composite-Interpretation werden alle vorkommenden Allele von Replikaten gezählt, bei der Consensus-Interpretation lediglich die reproduzierbaren Allele. Dabei stellte sich heraus, dass im Fall von wenigen Allelic Drop-ins (PowerPlex? ESX 17-generierte Profile) die Composite-Interpretation und bei Allelic Drop-in-haltigen Profilen (maSTR-generierte Profile) die Consensus-Interpretation am besten geeignet ist.
Schließlich wurde mittels der GenoProof Mixture 3-Software untersucht, inwieweit semi- und vollständig kontinuierliche probabilistische Verfahren bei der biostatistischen Bewertung der DNA-Profile aus Einzelhaaren geeignet sind. Dabei zeigte sich, dass der maSTR-Assay aufgrund der hohen Anzahl an Allelic Drop-ins den CE-basierten Methoden nur in Fällen von DNA leicht überlegen ist, die in ausreichender Menge und gering degradiert vorliegt. In diesem Bereich gelingt die Zuordnung des Profils aus Haaren zum Referenzprofil jedoch ebenfalls mittels CE-basierten Methoden.
Aus allen Ergebnissen wurde eine Empfehlung für die Handhabung von DNA aus ausgefallenen Einzelhaaren abgeleitet, die auf dem DNA-Degradierungsgrad in Kombination mit der DNA-Menge basiert. Die vorliegende Arbeit schafft somit eine Grundlage, um ausgefallene Einzelhaare in der Routine-Arbeit von kriminaltechnischen Ermittlungen nutzbar zu machen, sowie gegebenenfalls auf andere Spurentypen mit degradierter DNA geringer Menge anzuwenden. Dadurch könnte die Nutzbarkeit solcher Spurentypen für die forensische Kriminalistik erhöht werden, insbesondere wenn die standardmäßig verwendeten CE-basierten Methoden versagen. Perspektivisch ist die Technik der NGS aufgrund der großen Multiplexierbarkeit uniformer, kurzer Marker generell der CE-basierten Technik bei der Typisierung degradierter DNA überlegen.
Die Rolle des Insulin-Signaltransduktionsweges in der Kontrolle der Entwicklung, der Physiologie und der Lebensdauer eines Organismus wurde in den vergangenen Jahren eingehend untersucht. Aufgrund seiner evolutionären Konservierung konnte durch Modellorganismen wie C. elegans, Drosophila und Mus musculus ein schneller Fortschritt bei der Entschlüsselung von Komponenten dieses Signalweges gemacht werden. In Drosophila wurden sieben verschiedene Homologe des Säuger-Insulins identifiziert. Drei der „Drosophila insulin-like peptides“ (dilps) werden in den medianen neuroendokrinen Zellen des Gehirns exprimiert. Diese Insulin-produzierenden Zellen (IPCs) senden neuronale Projektionen in Zellen der Corpora cardiaca. In diesen Zellen wird das Glucagonhomolog AKH (Adipokinetisches Hormon) produziert, zudem sind sie in der Lage Insulin zu speichern. Die beiden Zelltypen können als funktionelles Homolog der A- und B-Zellen des Säuger-Pankreas angesehen werden.
Bisher wurden die Studien in Drosophila an Mutanten des Insulin-Signaltransduktionsweges und an teilweise IPC-defizienten Fliegen durchgeführt. In beiden Fällen konnte der beobachtete Phänotyp von entwicklungsbedingten Defekten und der verminderten Insulin-Signalwirkung selbst ausgelöst worden sein. In dieser Arbeit wurden mit Hilfe des spät in der Entwicklung aktiven dilp3-Promotors und der Apoptose-induzierenden Faktoren RPR (reaper) und HID (Head involution defective) die IPCs zerstört. Ein larvaler Phänotyp wie bei den Mutanten des Insulin-Signaltransduktionsweges war nicht zu beobachten. So war es nun möglich, den Effekt einer verminderten Insulin-Signalwirkung in Adulten getrennt von entwicklungsabhängigen Effekten zu betrachten. Es zeigte sich, dass IPC-defiziente Weibchen Probleme haben, sich unterschiedlichen Nahrungsbedingungen anzupassen. Sie konnten Glycogen und Körperfett nicht so leicht abbauen. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass bei Fütterung mit proteinreicher und kohlenhydratarmer Nahrung ihre Lebenserwartung gegenüber den Kontrollen erhöht war. Die Analyse dieser Fliegen mit Hilfe von cDNS-Microarrays führte zur Identifizierung des „target of brain insulin“ (tobi), einer α-Glucosidase, die im Darm und im Fettkörper von Adulten exprimiert wurde. TOBI ist evolutionär konserviert und es existiert ebenfalls ein menschliches Homolog. Das Transkript der α-Glucosidase wurde bei verminderter Insulin-Signalwirkung reprimiert, zudem wurde es abhängig von der Proteinkonzentration in der Nahrung reguliert. Durch die Zerstörung der AKH-produzierenden Zellen konnte tobi ebenfalls reprimiert werden. Dies zeigte, dass zusätzlich zu den IPCs auch die AKH-Zellen nötig waren, um das tobi-induzierende Signal weiterzuleiten. Diese Ergebnisse machen TOBI zu einem interessanten Zielgen des Insulinsignaltransduktionsweges, besonders seine mögliche Rolle im Alterungsprozess bedarf einer weiteren Untersuchung.