610 Medizin und Gesundheit
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The generation and maintenance of intricate spatiotemporal patterns of gene expression in multicellular organisms requires the establishment of complex mechanisms of transcriptional regulation. Estimations that up to one million enhancers exist in the human genome accentuates the utmost importance of this type of cis-regulatory element for gene regulation. However, surprisingly little is known about the mechanisms used to temporarily or permanently activate or inactivate enhancers during cellular differentiation. The current work addresses the question how enhancer regulation can be achieved.
Using the chemokine (C-C motif) ligand gene Ccl22 as a model, the first example is based on the question how the activation of an enhancer can be prevented in a physiological context. Ccl22 is expressed by myeloid cells, such as dendritic cells, upon exposure to inflammatory stimuli. The expression in other cell types, such as fibroblasts, is prevented by the strong accumulation of H3K9me3 at the enhancer's proximal region. This accumulation is attenuated in myeloid cells through activity of the stimulus-induced demethylase Jmjd2d. To tease out which genomic fragment or fragments in the Ccl22 locus could be responsible for the maintenance of enhancer inactivity, potentially through the recruitment of H3K9 methyltransferases, the enhancer repressing capacity of 1 kb fragments of the gene locus was analysed in retroviral reporter assays. It was found that a fragment adjacent to the Ccl22 enhancer that overlaps with a member of a subfamily of long interspersed nuclear elements (LINEs) showed strong repressive potential on a model enhancer. Subsequent retroviral reporter assays with LINEs from loci of other stimulus-dependent genes identified additional LINE fragments that exhibit strong enhancer repressive capacity. These findings suggest a mechanism for enhancer silencing involving LINEs.
The second example concentrates on the inactivation of an enhancer during colorectal cancer (CRC) progression. The adenoma to carcinoma transition during CRC progression often is accompanied by a downregulation of the tumour suppressor gene EPHB2. The EMT inducing factor SNAIL1 strongly downregulated EPHB2 expression in a CRC cell model. To gain insights into the transcriptional regulation of EPHB2, potential cis-regulatory elements in the EPHB2 upstream region were analysed using reporter assays. A cell-type-specific enhancer was identified and subsequent chromatin analyses revealed a correlation between enhancer chromatin conformation and EPHB2 expression in different CRC cell lines. Additionally, the overexpression of the murine Snail1 induced chromatin changes at the EPHB2 enhancer towards a poised, transcriptionally silent chromatin conformation. Mutational analyses of the minimal enhancer region pinpointed three transcription factor binding motifs to be essential for full enhancer activity. Different binding patterns between CRC cell lines at the TCF/LEF motif were subsequently identified. Furthermore, a switch from TCF7L2 to LEF1 occupancy was found upon overexpression of Snail1 in vitro and in vivo. The generation of LS174T CRC cells overexpressing LEF1 confirmed the involvement of LEF1 in the downregulation of EPHB2 and the competitive displacement of TCF7L2. This part of the work demonstrated that the SNAIL1 induced downregulation of EPHB2 is dependent on the decommissioning of a transcriptional enhancer and led to a hypothetical model involving LEF1 and ZEB1.
In summary, this work highlighted two distinct mechanisms for enhancer regulation. One mechanism is based on enhancer repressive LINE fragments that might prevent stimulus-dependent enhancer activation. In the second, enhancer silencing was shown to be based on a competitive transcription factor binding mechanism.
The present thesis elucidates the development of (i) a series of small molecule inhibitors reacting in a covalent-irreversible manner with the targeted proteases and (ii) a fluorescently labeled activity-based probe as a pharmacological tool compound for investigation of specific functions of the mentioned enzymes in vitro. Herein, the rational design, organic synthesis and quantitative structure-activity-relationships are described extensively.
Funktionseinschränkungen nach erworbener Hirnschädigung können die Mobilität der Betroffenen beeinträchtigen und zu gravierenden Änderungen des Lebensstils bis hin zur Inaktivität führen. Es ist davon auszugehen, dass ein inaktiver Lebensstil den Gesundheitszustand weiter verschlechtert und sich für die Betroffenen daraus ein erhöhtes Risiko für weitere chronische Erkrankungen ergibt. Bisherige Studienergebnisse beschreiben weder das Aktivitätsverhalten von Menschen mit erworbener Hirnschädigung noch wurden geeignete Interventionen zur nachhaltigen Steigerung der körperlichen Aktivität (KA) entwickelt. Ziel der vorliegenden Arbeit war es ein umfassendes Abbild des Aktivitätsverhaltens im Alltag von Menschen mit erworbener Hirnschädigung zu erstellen sowie die Machbarkeit und die Auswirkungen einer Bewegungsintervention auf das Aktivitätsverhalten und die Lebensqualität zu untersuchen.
In der vorliegenden Arbeit wurde ein Verfahren zur Analyse von Molekülen auf Grundlage ihrer molekularen Oberfläche und lokalen Werte für physiko-chemische und topografische Eigenschaften entwickelt. Der als Kernkomponente der Analyse entwickelte Fuzzy-Controller kombiniert molekulare Eigenschaften und selektiert die für Wechselwirkungen relevanten Merkmale auf der Oberfläche. Die Ergebnisse des Fuzzy-Controllers werden für die Berechnung von 3D-Deskriptoren und für die Visualisierung der ermittelten Domänen auf der Oberfläche herangezogen. Es werden zwei Arten von Deskriptoren berechnet. Deskriptoren, welche Flächeninhalte und Zugehörigkeiten zu den spezifizierten Bindungsmerkmalen der Domänen darstellen, und Deskriptoren, welche die räumliche Anordnung der Domänen zueinander beschreiben. Die vom Fuzzy-Controller überarbeitete Oberfläche wird im VRML-Format zur Visualisierung und weiteren Bearbeitung zur Verfügung gestellt. Die berechneten Deskriptoren werden zur Ähnlichkeitsanalyse von Liganden und zur Suche von komplementären Bereichen an der Bindungsstelle einesRezeptors eingesetzt. MTX in protonierter Form und DHF, die an das Enzym DHF-Reduktase binden, und die Inhibitoren Sildenafil, Tadalafil und Vardenafil des Enzyms PDE-5A wurden unter Ähnlichkeitsaspekten analysiert. Bei der Bestimmung von komplementären Bindungsmerkmalen wird ausgehend von den Bindungsmerkmalen eines Liganden nach komplementären Bereichen in der Bindungstasche des Rezeptors gesucht. Als Anwendungsbeispiele werden die Bindungsstelle des Enzyms DHF-Reduktase aus den Komplexen mit MTX und DHF und des Enzyms PDE-5A aus den Komplexen mit Sildenafil, Vardenafil und Tadalafil betrachtet. Insgesamt haben die Anwendungsbeispiele gezeigt, dass der vorgestellte Fuzzy-Controller Bindungsmerkmale auf der molekularen Oberfläche identifiziert unddie darauf basierenden, rotations- und translationsinvarianten Deskriptoren zur Ähnlichkeitsanalyse und zur Suche von komplementären Bereichen angewendet werden können.